轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信號通路是一條重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在早期胚胎發(fā)育和調(diào)節(jié)成人組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，廣泛存在于脊椎和無脊椎動物中。異常的TGF-β超家族信號與多種人類疾病相關(guān)，包括自身免疫、心血管、纖維化疾病以及癌癥等。
生物體內(nèi)的TGF-β信號持續(xù)激活I(lǐng)I型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體并與之結(jié)合形成較大分子量的異源復(fù)合物，隨后募集、自動磷酸化II型受體；后者與I型受體結(jié)合后激活胞內(nèi)的特異性靶分子(Smad蛋 白)，隨后進(jìn)入細(xì)胞核，在輔助因子的幫助下識別并結(jié)合目標(biāo)基因啟動子區(qū)域的特異性序列，擴(kuò)增Smad依賴的靶基因轉(zhuǎn)錄[3]。信號通路在細(xì)胞內(nèi)外受到嚴(yán)格而復(fù)雜的調(diào)控，通路中轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的活性在調(diào)節(jié)過程中影響巨大，任何信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子活性改變都可能導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展。TGF-β家族成員根據(jù)腫瘤的不同階段釋放抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的信號，不僅調(diào)控腫瘤細(xì)胞的活動，甚至對腫瘤微環(huán)境和機(jī)體產(chǎn)生巨大的效應(yīng)。中藥作為中華民族的醫(yī)學(xué)瑰寶，在臨床上應(yīng)用了數(shù)千年，憑借多組分、多靶點、副作用小的特性在改善腫瘤患者的預(yù)后和生存率方面作用突出。對中藥抗癌機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥單體或復(fù)方可通過TGF-β/Smad信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生命活動和腫瘤惡性轉(zhuǎn)移、浸潤等過程，為抗癌藥的研發(fā)及腫瘤治療提供新策略。
1 TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包含三部分：TGF-β超家族、TGF-β受體和Smads蛋白家族。
1.1 TGF-β超家族
TGF-β超家族由一類在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子組成，包括兩個功能組：TGF-β/激活素(Activin)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)/生長分化因子(growth and differentiation factor, GDF)。根據(jù)序列相似性將功能組進(jìn)一步劃分，TGF-β/Activin分支包括TGF-β、激活素、抑制素、節(jié)點和左配體；BMP/GDF分支包括BMP、GDF和苗勒管抑制素[4]。其中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類從骨基質(zhì)中分離提取出來的酸性疏水性糖蛋白[5]，與Nodal/Activin在早期胚胎發(fā)育的體軸形成中起關(guān)鍵作用。苗勒管抑制素是一種產(chǎn)生于睪丸的顆粒細(xì)胞，具有抑制苗勒管發(fā)育的生理作用[9]。TGF-β是一組序列高度相關(guān)的細(xì)胞因子，已知有5種異構(gòu)體(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5)，習(xí)慣上將TGF-β1稱為TGF-β[10]。TGF-β以無活性的形式分泌，它由成熟配體與潛伏相關(guān)蛋白(latency associated peptide, LAP)非共價連接的同二聚體組成，無活性的TGF-β不結(jié)合TGF-β的受體，也沒有已知的生物學(xué)功能[11]。LAP是TGF-β前體的一部分，通過二硫鍵與另一個稱為潛在TGF-β結(jié)合蛋白(latent TGF-β-binding protein, LTBP)的兩個半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，形成一種由TGF-β、LAP和LTBP三部分組成的潛在復(fù)合物(large latent complex, LLC)[12]。不同的細(xì)胞外蛋白酶可以裂解LTBP或LAP，將成熟的TGF-β從復(fù)合物中釋放出來發(fā)揮作用[4]。有數(shù)據(jù)證實，TGF-β在多種腫瘤中過度表達(dá)，介導(dǎo)的信號通路在腫瘤中起著重要作用[13]。
1.2 TGF-β受體
TGF-β受體是一種普遍存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，被配體激活后將胞外信號傳遞到胞內(nèi)。TGF-β受體主要發(fā)揮介導(dǎo)作用的受體是三個高度同源的亞型：TβRI(TGF-β type I receptor)、TβRII和TβRIII。TβRI和TβRII由N-末端糖基化的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)C-末端絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)3個部分組成[14]。TβRI、TβRII的胞外區(qū)均含有大約10個半胱氨酸殘基構(gòu)成的區(qū)域，稱為“Cys盒”。
TβRI胞
內(nèi)側(cè)近膜處有高度保守的調(diào)控區(qū)，稱為GS結(jié)構(gòu)域。GS結(jié)構(gòu)域是一個關(guān)鍵的調(diào)控區(qū)域，包含一個特殊的SGSGSG序列，可能控制I型受體激酶的催化活性或與底物的相互作用。TβRII胞內(nèi)側(cè)羧基端富含Thr和Ser的短尾，因此它可自主激活。TβRII與TGF-β特異性結(jié)合并與TβRI形成異源復(fù)合物，磷酸化2型受體GS結(jié)構(gòu)域啟動胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)。TβRIII無激酶活性不參與TGF-β信號的傳導(dǎo)，可促進(jìn)和拮抗受體結(jié)合配體，促進(jìn)作用通過與TβRI、TβRII形成復(fù)合物結(jié)合配體實現(xiàn)。
1.3 Smads蛋白家族
Smads蛋白群是TGF-β家族中重要的一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子。激活的Smads可通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)各種不同的生物學(xué)效應(yīng)。在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)8種不同的蛋白，根據(jù)功能的不同分為三種亞型：受體激活型Smad(R-Smads)、共同型Smad(Co-Smads)和抑制型Smad(I-Smads)。所有Smad蛋白一級結(jié)構(gòu)包括Mad同源結(jié)構(gòu)域N端區(qū)(mad homo logues 1, MH1)、C端區(qū)(MH2)和中間連接區(qū)，MH1介導(dǎo)DNA結(jié)合，MH2介導(dǎo)Smad寡聚化[11]。
R-Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。R-Smads均有一個C端SSXS基序，最后兩個絲氨酸可被I型受體直接磷酸化。Smad2、Smad3轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β/Activin通路信號。Smad1、Smad5、Smad8作為TGF-β家族中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)通路受體底物參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。Co-Smad僅有Smad4。Smad4中間連接區(qū)富含脯氨酸，是轉(zhuǎn)錄激活的必需區(qū)域，可以與所有MH2區(qū)域被磷酸化的R-Smad蛋白結(jié)合形成異源三聚體[19]。I-Smads分為Smad6、Smad7，兩者均為抑制因子負(fù)反饋調(diào)控TGF-β/Smad通路的活性。Smad7可經(jīng)由p300介導(dǎo)的乙?；瘏⑴cTGF-β引發(fā)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[20]，其拮抗信號傳遞的機(jī)制與競爭性結(jié)合受體I，阻斷受體激活型Smad的活化有關(guān)[21]。Smad6除了與Smad1競爭結(jié)合Smad4，還可以與共抑制子CtBP協(xié)同作用于BMPs信號通路，起到負(fù)調(diào)控該信號通路的作用[22-23]。
Smad基因突變或功能失活導(dǎo)致人體多種病理進(jìn)程的發(fā)生，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[24]。
2 TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤TGF-β/Smads通路在腫瘤發(fā)生過程中隨階段不同表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)效果。在生理階段以及腫瘤發(fā)生早期，TGF-β抑制作用通過促進(jìn)細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)得以實現(xiàn)。在腫瘤進(jìn)展的后期階段，該通路的核心組成部分由于突變或雜合性等位基因缺失而喪失活性，造成抑制腫瘤TGF-β信號消失，并伴有抑制機(jī)體免疫監(jiān)控系統(tǒng)，協(xié)同腫瘤血管生成，形成適于腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的胞外微環(huán)境等反應(yīng)[25]。
2.1 TGF-β/Smads與腫瘤的生長
在正常的生理情況下，TGF-β可干擾細(xì)胞的正常周期抑制細(xì)胞增殖，或通過促凋亡作用抑制腫瘤發(fā)生。TGF-β受體和Smad蛋白的結(jié)合可將有關(guān)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，促進(jìn)G1期細(xì)胞周期停滯抑制其增殖[26-27]。在上皮細(xì)胞中，TGF可以通過上調(diào)細(xì)胞靜態(tài)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKI)、p51和p21，同時下調(diào)生長刺激蛋白，尤其是c-Myc和Id(inhibitors of differentiation)家族成員來觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯[28]。有絲分裂轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達(dá)抑制可使下游蛋白CDK對細(xì)胞周期抑制蛋白p15Ink4b和p21Cipl的抑制作用喪失，且通過Smad信號聯(lián)合其他通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞喪失增殖能力[29]。同時，TGF通過對Id家族的轉(zhuǎn)錄抑制使細(xì)胞喪失分化功能，導(dǎo)致生長停滯。例如TGF可通過激活Smad3直接促進(jìn)應(yīng)激反應(yīng)因子(activating transcription factor 3, ATF3)的表達(dá)，使得ATF3和Smad3形成一個復(fù)合物，直接介導(dǎo)Id1抑制[30]。在上皮細(xì)胞和腫瘤初生期間，TGF-β作為腫瘤抑制因子借助Smad2/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制惡性細(xì)胞的生長[31]。TGF-β可在一些細(xì)胞類型中作為凋亡誘導(dǎo)物介導(dǎo)基因反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡，如TIEG(TGF-β-inducible-early-response gene)可在胰腺上皮細(xì)胞中被TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)促使細(xì)胞凋亡[32]。
2.2 TGF-β/Smads調(diào)控腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移
TGF-β在腫瘤發(fā)生晚期發(fā)揮促癌作用，通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transi tion, EMT)、刺激腫瘤血管生成、協(xié)同腫瘤逃避免疫監(jiān)視及合成適宜的胞外基質(zhì)微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞擺脫許多上皮特性獲得各種間充質(zhì)細(xì)胞特征的過程，該過程受到特定細(xì)胞因子的調(diào)控，如Snail/Slug、ZEB1/2等[33]。
EMT過程導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏著特性減弱而轉(zhuǎn)移特性增強(qiáng)，局部浸潤后進(jìn)入淋巴管和血管被輸送到全身，是腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要機(jī)制之一。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中，上皮細(xì)胞-細(xì)胞黏附蛋白，如E-鈣黏蛋白、ZO-1(zonula occludens-1)和阻塞素等的表達(dá)下調(diào)，而如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等的表達(dá)上調(diào)[34]。其中，E-cadhetin表達(dá)缺失被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生EMT作用的重要標(biāo)志，TGF-β可通過影響多種轉(zhuǎn)錄因子如Id、SKIP(ski interacting protein)、MRTFs(myocardin-related transcription fac tors)、Snail、ZEB等，使得E-cadherin表達(dá)缺失[35]。
有研究證實，Smad3、Smad4在EMT過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[36]。Smad3可與多種與EMT作用有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子直接或間接結(jié)合影響E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生。Smad2也被證實可與Ha Ras致癌基因合用增強(qiáng)癌細(xì)胞中的EMT作用[37]。多種中藥成分通過降低P-Smad2/3及EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail、E-cadherin的含量抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲，TGF-β/Smad信號通路是中藥靶向調(diào)控EMT作用的關(guān)鍵[38-40]。
血管生成為腫瘤提供所需的營養(yǎng)，TGF-β促進(jìn)持續(xù)的血管生成有利于侵襲和轉(zhuǎn)移[41]。低水平的TGF-β通過上調(diào)血管生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、bFGF(basic fibroblast growth factor)、CTGF(connective tissue growth factor)和蛋白酶的表達(dá)和活性間接促進(jìn)血管生成[42-43]。同時，TGF-β可誘導(dǎo)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，負(fù)調(diào)控金屬蛋白酶抑制因子，增加微環(huán)境中的蛋白酶。MMPs是促進(jìn)血管內(nèi)皮基底膜降解最重要的酶系，其活性增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤血管新生[44]。
免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用具有識別、殺傷并及時清除體內(nèi)突變細(xì)胞，防止腫瘤發(fā)生的功能，是機(jī)體抗腫瘤發(fā)生的重要屏障。TGF-β通過影響多種免疫細(xì)胞的增殖、分化和存活發(fā)揮抗腫瘤免疫的不良作用，顯著抑制宿主腫瘤免疫監(jiān)視[45]。TGF-β通過抑制自然殺傷細(xì)胞和CD8+-CTL(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)的功能，阻斷穿孔蛋白、顆粒酶和細(xì)胞毒素等關(guān)鍵蛋白的“細(xì)胞毒程序”[46]。另外，TGF-β誘導(dǎo)Treg和Th17細(xì)胞分化，抑制B細(xì)胞增殖和IgA分泌，干擾細(xì)胞免疫功能。Smad2/3/4對iTreg細(xì)胞的分化都很重要，然而對于Th17細(xì)胞的生成，Smad2是必要的，而Smad3/4是可有可無的[47]。此外，TGF-β抑制樹突狀細(xì)胞的功能成熟，阻斷I型巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)II型巨噬細(xì)胞發(fā)育，介導(dǎo)髓樣免疫抑制細(xì)胞(myeloid immune suppressor cells, MISCs)的免疫抑制功能使得腫瘤脫離免疫系統(tǒng)控制，導(dǎo)致腫瘤在宿主體內(nèi)的浸潤、轉(zhuǎn)移。不僅如此，與腫瘤相關(guān)的免疫微環(huán)境中多種免疫因子是腫瘤EMT的有效誘導(dǎo)因子[48]。
實體腫瘤的基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由ECM(extracellular matrix)蛋白(主要是I型膠原)和多種細(xì)胞類型組成，包括間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和骨髓源干細(xì)胞等[49]。這些細(xì)胞均表達(dá)TGF-β受體，因此TGF-β途徑異常可產(chǎn)生微環(huán)境纖維化、血管生成和免疫細(xì)胞浸潤等利于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的條件。癌細(xì)胞生成的TGF-β1激活周圍環(huán)境中的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞，激活的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌各種促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和對化療抵抗的因子，包括EGF、IGF-1(insulin like growth factor-1)、PDGF(platelet-derived growth factor)、FGF、MMP等，這些因子造成的低氧微環(huán)境對更具侵襲性的癌細(xì)胞表型具有選擇性[50]，進(jìn)一步增強(qiáng)惡性腫瘤的侵襲力。Smad4的突變失活被證實有助于創(chuàng)造有利腫瘤的微環(huán)境[51]。
3 中藥成分通過TGF-β/Smad通路對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用
3.1 對腫瘤細(xì)胞生長的調(diào)控作用
李妍等[52]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有拮抗小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤微血管形成，導(dǎo)致瘤體生長受阻的作用。免疫組化檢測顯示，姜黃素可上調(diào)拮抗因子Smad7的表達(dá)，下調(diào)Smad3的表達(dá)。他們推測，姜黃素對瘤體生長的抑制作用一方面通過增加Smad7的表達(dá)量，減少TGF-β1在瘤體中的過度表達(dá)；另一方面通過減少Smad3的表達(dá)阻斷TGF-β通路的信號傳遞，達(dá)到降低腫瘤新生血管密度、抑制瘤體生長的目的。因此，姜黃素對瘤體生長的抑制是通過TGF-β/Smad通路得以實現(xiàn)的。血根堿(sanguinarine, SA)是從罌粟科植物博落回中分離出的一種苯并菲啶異喹啉類生物堿，可對多種類型的癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性[53]。有研究發(fā)現(xiàn)，血根堿通過增加卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol對紫杉醇的敏感性來增強(qiáng)藥物的毒性作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的耐藥現(xiàn)象，促進(jìn)卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。研究結(jié)果顯示，血根堿可顯著抑制TGF-β1、正調(diào)控因子Smad3表達(dá)，上調(diào)負(fù)調(diào)控因子Smad7表達(dá)[54]，其抗腫瘤作用可能是抑制TGF-β/Smad途徑活性進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol凋亡[54]。
3.2 對腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用
靳祎祎等對白花蛇舌草的研究發(fā)現(xiàn)，其乙醇提取物具有抑制大腸癌細(xì)胞增殖及遷移、侵襲的作用。Transwell實驗結(jié)果證實，白花蛇舌草乙醇提取物對大腸癌HCT-8細(xì)胞轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)白花蛇舌草乙醇提取物干預(yù)后，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)受到干擾，N-cadherin、Vimentin表達(dá)被抑制，E-cadherin表達(dá)量增加；同時TGF-β通路中重要因子TGF-β、Smad4的表達(dá)被明顯下調(diào)，P-Smad2/3復(fù)合物表達(dá)量與正常表達(dá)的Smad2/3復(fù)合物相比被顯著抑制。他們的研究揭示，白花蛇舌草抑制大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是抑制TGF-β/Smad信號通路激活EMT。李慧杰等[56]研究表明，芪連扶正膠囊含藥血清抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移，抑制效果隨濃度增加而增強(qiáng)，在聯(lián)合化療條件下效果尤甚。芪連扶正膠囊可通過下調(diào)Smad7、TGF-β1 mRNA的表達(dá)，抑制TGF-β/Smad通路過度興奮，防止肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變發(fā)生，產(chǎn)生抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的效果。消巖湯是以白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣為君藥，聯(lián)合郁金、姜黃、黃芪與太子參組成的中藥復(fù)方，在臨床應(yīng)用中抗癌效果顯著。李小江等[57]證實，消巖湯在體外環(huán)境中對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有抑制作用，RT-PCR顯示實驗組炎性因子TGF-β表達(dá)受到明顯抑制，Western blot檢測的P-Smad3及MMP-9的蛋白表達(dá)均被下調(diào)，提示消巖湯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可能與抑制非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境中TGF-β/Smad3信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。
4 問題與展望在多種實體瘤中，不同中藥復(fù)方或單體通過TGF-β/Smad通路對腫瘤生長、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等活動產(chǎn)生顯著的抑制作用，明顯改善晚期腫瘤患者的生存和預(yù)后情況，但具體的機(jī)制以及與其他通路的協(xié)同作用十分復(fù)雜，仍待進(jìn)一步研究。
同時，對于中藥靶向EMT研究雖取得一定進(jìn)展，參與EMT作用的通路及相關(guān)分子是中藥發(fā)揮抑制調(diào)控作用的重要靶點，但需要進(jìn)一步的研究確定中藥調(diào)控作用的分子機(jī)制以及與其他通路的聯(lián)系。深入研究EMT作用的調(diào)節(jié)分子，確認(rèn)與其他通路之間的共調(diào)節(jié)分子可能為中藥抗癌藥的研發(fā)提供新的作用靶點。（作者：王仕嬌，王 純，張 敏，陳思敏，陳金銘，胡 衛(wèi)，曾建紅，陳 濤）